AAT Bioquest 1023/1029/1030 iFluor® 488/594/633 succinimidyl ester

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美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學研究、診斷研發及藥物開發的科學家研發、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發光技術。AAT Bioquest的產品幫助quan世界的科學家和生物醫藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。AAT Bioquest會不斷介紹新產品，快速的豐富各個領域的產品。

AAT Bioquest 1023  iFluor® 488 succinimidyl ester  1 mg

AAT Bioquest  1029  iFluor® 594 succinimidyl ester  1 mg

AAT Bioquest  1030  iFluor® 633 succinimidyl ester  1 mg

AAT Bioquest iFluor® 488 succinimidyl ester

AAT Bioquest 1023  iFluor® 488 succinimidyl ester 1 mg，產品說明：

盡管FITC仍然是制備綠色熒光生物偶聯物zui常用的熒光標記染料，但FITC存在一定的局限性，例如顯微鏡成像的嚴重光漂白和pH敏感熒光。用iFluor® 488染料制備的蛋白質偶聯物遠遠優于熒光素衍生物（如FITC）的偶聯物。iFluor® 488偶聯物比熒光素偶聯物明顯更亮，并且更易于光化。此外，iFluor® 488的熒光不受pH值（4-10）的影響。這種pH不敏感性是對熒光素的重大改進，熒光素僅在pH高于9時發出最大熒光。iFluor® 488 SE染料相當穩定，對蛋白質氨基基團具有良好的反應性和選擇性。這款iFluor 488具有類似于Alexa Fluor 488 NHS酯的光譜特性和反應性（Alexa Fluor®®®是Invitrogen的商標）。

示例協議

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復凍融循環。

蛋白質儲備溶液（溶液A）

1. 將 100 μL 反應緩沖液（例如，pH ~1.1 的 9 M 碳酸鈉溶液或 0 M 磷酸鹽緩沖液）與 900 μL 目標蛋白溶液（例如抗體、蛋白質濃度 >如果可能，為 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白質標記儲備溶液。

注意： 蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH值低于8.0，則使用8 M碳酸qing鈉溶液或0 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節至1.1-9.0的范圍。

注意： 蛋白質應溶解在1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白質溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（如**銨和乙**）。

注意： 不純抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩定的抗體將無法很好地標記。疊***或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應。疊***或硫柳汞可以通過透析或離心柱去除，以獲得最佳標記結果。

注意： 如果蛋白質濃度低于2 mg/mL，偶聯效率會顯著降低。建議最終蛋白質濃度范圍為 2-10 mg/mL，以獲得最佳標記效率。

iFluor™ 488 SE儲備液（溶液B）

1. 將無水DMSO加入iFluor™ 488 SE的小瓶中，制成10 mM儲備溶液。通過移液或渦旋充分混合。

注意： 在開始偶聯之前制備染料儲備溶液（溶液B）。請及時使用。延長染料儲備溶液的儲存可能會降低染料活性。溶液B在避光和潮濕的情況下可以在冰箱中儲存兩周。避免凍融循環。

實驗方案樣本

該標記方案是為山羊抗小鼠IgG與iFluor™ 488 SE的偶聯物開發的。您可能需要進一步優化您的特定蛋白質。

注意： 每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比例的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。

運行偶聯反應

1. 使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的10：1摩爾比作為起點：將5 μL染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入蛋白質溶液（95 μL溶液A）的小瓶中，有效搖勻。假設蛋白質濃度為0mg / mL，蛋白質的分子量為~05KD，蛋白質的濃度為~10.200mM。

注意： 我們建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10：1。如果太少或太高，請分別在 5：1、15：1 和 20：1 確定最佳染料/蛋白質比例。

2. 繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化偶聯

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱純化的染料-蛋白質偶聯物的示例。

1. 根據制造說明制備Sephadex G-25色譜柱。

2. 將反應混合物（來自“運行共軛反應"）加載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。

3. 一旦樣品剛好在頂部樹脂表面下方運行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4. 向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。合并含有所需染料-蛋白質偶聯物的級分。

注意： 為了立即使用，染料-蛋白偶聯物必須用染色緩沖液稀釋，并等分用于多種用途。

注意： 對于長期儲存，染料-蛋白質偶聯物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

產品系列

AAT Bioquest  1029  iFluor

AAT Bioquest  1029  iFluor® 594 succinimidyl ester  1 mg，產品說明：

iFluor 594琥珀酰亞胺酯是iFluor系列熒光標記染料之一，可以覆蓋整個可見光譜。 所有iFluor 染料都具有優異的水溶性。 它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。 與常規的染料(如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7)相比，iFluor 染料具有更好的標記性能。 一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優于Alexa Fluor 標記染料。 它們是用于標記蛋白質和核酸的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。 每種iFluor染料的開發都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的ji佳試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。 這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。 當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1.溶劑：在大多數情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2.反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。 胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應，包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。 因此，胺酰化反應通常在pH 7.5以上進行。 通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通常可以在pH 8.5-9.5下進行。 3.反應緩沖液：使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘an酸）和硫醇化合物的緩沖液。 廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4.反應溫度：大多數綴合在室溫下進行。 特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。 iFluor系列染料是AF系列染料的wan美替代品。

AAT Bioquest  1030  iFluor® 633 succinimidyl ester，產品說明：

iFluor 633琥珀酰亞胺酯是iFluor系列熒光標記染料之一，可以覆蓋整個可見光譜。 所有iFluor 染料都具有優異的水溶性。 它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。 與常規的染料(如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7)相比，iFluor 染料具有更好的標記性能。 一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優于Alexa Fluor 標記染料。 它們是用于標記蛋白質和核酸的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。 每種iFluor染料的開發都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的 ji jia試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩定。 這些試劑通常是穩定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。 當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1.溶劑：在大多數情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2.反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。 胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應，包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。 因此，胺酰化反應通常在pH 7.5以上進行。 通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通常可以在pH 8.5-9.5下進行。 3.反應緩沖液：使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘an酸）和硫醇化合物的緩沖液。 廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4.反應溫度：大多數綴合在室溫下進行。 特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。 iFluor系列染料是AF系列染料的wan美替代品。

AAT Bioquest iFluor® 488 succinimidyl ester

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