熒光定量PCR（qPCR）試劑盒作為分子診斷與基因表達分析的核心工具，通過熒光信號實時監(jiān)測DNA擴增過程，實現(xiàn)高靈敏度、高特異性的核酸定量檢測。其操作流程涵蓋樣本制備、反應(yīng)體系配制、上機運行及數(shù)據(jù)分析四大環(huán)節(jié)，嚴格遵循標準化步驟可確保結(jié)果可靠。本文以常見病毒核酸檢測或基因表達分析為例，詳解
熒光定量試劑盒的使用方法。
一、樣本制備：從生物材料到純化核酸的關(guān)鍵步驟
1.樣本采集與保存
①臨床樣本（如咽拭子、血液）需置于病毒保存液或EDTA抗凝管中，4℃短期保存（≤24小時）或-80℃長期凍存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致核酸降解。
②細胞樣本需用PBS洗滌去除培養(yǎng)基，每1×10?細胞加入500μL裂解液（含蛋白酶K），56℃孵育10分鐘至全部裂解。
2.核酸提取與純化
①使用磁珠法或離心柱法提取核酸，推薦使用試劑盒配套的洗脫緩沖液，最終核酸濃度建議≥10ng/μL（DNA）或≥50ng/μL（RNA）。
②質(zhì)控標準：通過分光光度計檢測A260/A280比值，并跑瓊脂糖凝膠電泳確認核酸完整性。
二、反應(yīng)體系配制：精準控制避免實驗偏差
1.試劑解凍與混勻
將試劑盒中的2×qPCR Master Mix、引物探針混合液及ROX參考染料（若需）置于冰上緩慢解凍，渦旋振蕩10秒后短暫離心收集液體。
三、上機運行與數(shù)據(jù)采集：設(shè)置程序與監(jiān)控擴增曲線
1.儀器程序設(shè)置
①預(yù)變性：95℃ 3分鐘（激活熱啟動Taq酶）；
②擴增循環(huán)：40個循環(huán)（95℃ 15秒→60℃ 1分鐘），采集60℃階段的熒光信號；
③熔解曲線分析（可選）：95℃ 15秒→60℃ 1分鐘→95℃ 15秒，用于驗證引物特異性。
2.結(jié)果判讀標準
①陽性結(jié)果：Ct值≤35且擴增曲線呈典型S型，熔解曲線為單一峰；
②陰性結(jié)果：NTC無擴增，樣本Ct值＞40或無曲線；
③灰區(qū)處理：35＜Ct≤40的樣本需重復(fù)檢測或采用其他方法驗證。
四、注意事項：規(guī)避常見操作誤區(qū)
1.防污染控制：全程在超凈工作臺內(nèi)操作，使用帶濾芯的槍頭，分裝試劑后避免反復(fù)凍融；
2.引物探針設(shè)計：確保GC含量40%-60%，Tm值相差≤2℃，避免二聚體形成；
3.儀器校準：定期用標準品校正熒光通道基線，確保檢測靈敏度。
熒光定量試劑盒的標準化操作是獲得可靠數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。通過嚴格質(zhì)控樣本、精準配制反應(yīng)體系及科學(xué)分析結(jié)果，可廣泛應(yīng)用于病原體檢測、基因表達定量及SNP分型等領(lǐng)域，為臨床診斷與科研研究提供強有力的技術(shù)支持。
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更新時間：2025-08-26 
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